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細(xì)胞轉(zhuǎn)染的一些事兒

 更新時(shí)間:2022-01-21 點(diǎn)擊量:2082

轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備:

材料:293T細(xì)胞(其他的細(xì)胞系種類)、MyoD表達(dá)質(zhì)粒EGFP表達(dá)質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸鹽緩沖溶液)、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑TransFast

器材:20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭、酒精燈、廢液缸、血球計(jì)數(shù)板渦旋振蕩器、恒溫水浴箱、臺(tái)式離心機(jī)、35mm培養(yǎng)皿、轉(zhuǎn)染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡CCD

1、細(xì)胞傳代培養(yǎng):取出細(xì)胞群,去除培養(yǎng)基,使用PBS清洗2次。

Tip頭加入1ml Trypsin液(胰蛋白酶),消化1分鐘(37。C,5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁,觀察到細(xì)胞*從壁上脫落下來(lái)為止。

加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

Tip頭多次吹吸,使細(xì)胞*分散開(kāi)。

將培養(yǎng)液裝入離心管中,1000rpm離心5min。

用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞放入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。

將合適體積*培養(yǎng)液加入離心管中,混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中,使其均勻分布。

將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第二天轉(zhuǎn)染(當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50-80%時(shí),可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染)。

轉(zhuǎn)染過(guò)程:

1轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備

A.400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。

B.震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。

2選擇合適的混合比例(1112/脂質(zhì)體體積:DNA質(zhì)量)來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFPDNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,再次震蕩。

3)將混合液在室溫放置10—15分鐘。

4吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。

5)加入混合液,將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。

6)到時(shí)后,根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液,之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2448小時(shí)。

第二次細(xì)胞傳代

1)在轉(zhuǎn)染后24小時(shí),觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

2)再次進(jìn)行細(xì)胞傳代,按照免疫染色合適的密度0.8X105個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新放入培養(yǎng)皿中。

3)在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。

篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞:

1.確定抗生素作用的理想濃度:

不同的細(xì)胞株對(duì)各種抗生素有不同的敏感性,因此在篩選前要做預(yù)試驗(yàn),確定抗生素對(duì)所選擇細(xì)胞的作用濃度。

1) 提前24 小時(shí)在96 孔板或24 孔板中接種細(xì)胞,接種量以第二天長(zhǎng)成25%單層為宜,置CO2 孵箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

2) 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基,抗生素濃度按梯度遞增(0, 50, 100, 200,400, 600, 800 1000μg/ml)。

3) 培養(yǎng)10-14 天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),一般為400-800μg/ml,篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時(shí)可比該濃度適當(dāng)提高一個(gè)級(jí)別維持時(shí)使用篩選濃度的一半。最終得到和合適的抗生素濃度。

2.轉(zhuǎn)染按前面的步驟進(jìn)行。

3.轉(zhuǎn)染72 小時(shí)后按1:10 的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6 孔板中傳代,換為含預(yù)試驗(yàn)中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基。在6 孔板內(nèi)可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞分裂繁殖形成單個(gè)抗性集落,此時(shí)可用兩種方法挑選單克隆。

1) 濾紙片法:用消毒的5x5mm 濾紙片浸過(guò)胰酶,將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上10-15 秒,取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于24 孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng)。細(xì)胞在24 孔板中長(zhǎng)滿后轉(zhuǎn)入25cm 培養(yǎng)瓶中,長(zhǎng)滿后再轉(zhuǎn)入75cm 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

2) 有限稀釋法:將細(xì)胞通過(guò)酶消化下來(lái)后做連續(xù)的10 倍稀釋(10-2—10-10),將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到96 孔板中培養(yǎng),7-10 天后,選擇單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔再一次進(jìn)行克隆。

4. ELISA Western blot 檢測(cè)單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的表達(dá)水平存在差異因此可同時(shí)挑選多個(gè)克隆選擇表達(dá)量最高的克隆傳代并保種。

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